VHP空间灭菌技术

洁净室普通的灭菌方法难以标准化，劳动密集，验证困难，并且对操作工和环境存在潜在的危险。与空调系统结合在一起的VHP灭菌技术除了能够克服传统灭菌技术的缺点外，还具有如下优点：极好的材料兼容性，广谱杀菌功效，可以再生，无菌保证水平更高。所以研究VHP如何与空调系统相结合进行空间灭菌对未来的生物医药洁净室规模化、标准化空间灭菌有着重要的实际指导意义。

VHP（Vaporized Hydrogen Peroxide）即气化过氧化氢，近些年来关于气态过氧化氢的灭菌效果不断有研究报导， 其主要原理是生成游离的氢氧基，用于进攻细胞成分，包括脂类，蛋白质和 DNA，并已被广泛用于生物制药行业的灭菌[1-2]。
VHP灭菌与传统灭菌方式技术的比较已经有研究[3-4]，从各种比较可知，VHP灭菌方式无论从灭菌的效果、灭菌后的残留物、灭菌时间、适用场合以及在实际灭菌过程中对作业人员的伤害性，相对传统的灭菌方式都有其显而易见的优势。

2015年，我司承接的土耳其V项目在安卡拉投资设立了动物疫苗制造车间，生产过程中采用对动物疫苗有高抗性的原料。在生产核心区的动物孵化、药品灌装车间及动物实验室等洁净间，生产过程中会有原料、中间体进出生产区，这就要求有高效、可靠的灭菌方法来进行物料表面及对空间进行灭菌，同时需要以最小的操作时间来完成物料的转移。针对本项目的特点，需要在各种灭菌工艺中寻找到合适的灭菌方法来实现。

在考虑各种综合解决方案的过程中，针对使用方提出的几点要求，一是灭菌频率高，这就要求尽量缩短操作周期；二是尽量采用干式灭菌法，以减少灭菌环节对洁净室整体受控环境的影响。

根据以往国内的项目经验及对欧盟GMP的理解，并综合考虑项目的实际运行操作情况及远程技术沟通及远程设备材料运输等一系列情况，本项目最终选用了固定式VHP发生器对洁净空间系统进行灭菌的方式，这样更能适应本项目的要求。

（1）某项目采用固定式VHP结合空调系统对房间进行空间灭菌。如图1、图2所示。

（2）VHP灭菌过程
除湿——降低空间的相对湿度，达到期望VHP灭菌所需要的湿度水平。
保持VHP发生器设备连接到风管系统的阀门关闭，系统经空调机组运行，通过转轮除湿功能段尽量降低湿度，使空调系统及房间内的空气达到洁净系统所需的洁净等级及温湿度要求即可。即VHP 灭菌在低湿（湿度＜40%）状态灭菌效果最佳。

调节——增加注射速率，减少循环时间，从而快速增加H2O2浓度。

关闭空调系统的新风阀、排风阀，关闭空调系统的冷热源阀门，打开通至房间的干空气调节阀至全开位置，打开VHP管路与空调系统连接之阀门至全开位置，同时开启VHP发生器，过氧化氢加液装置给VHP发生装置供给液态过氧化氢，过氧化氢气体发生装置将液态过氧化氢转换为气态，然后经过送风支管（如图3)、送风风口传输至各需要灭菌的洁净空间内，对房间、物料、产品和设备等进行灭菌。在VHP和干燥空气进入密闭洁净空间的同时，根据通入的气体量通过自控系统对排风阀门进行调节。此调节过程中保持整个空调系统的相对湿度大约为 50%。

生物除污染——保持一定的H2O2浓度，具有恒定的“灭菌”能力。

使空调系统风管、房间、设备等空间内保持一定的VHP浓度，达到灭菌的效果。本项目设定607mg/m3 的浓度值。

通风——含循环、快速减少H2O2的浓度，达到健康、安全的目的。
灭菌结束后，关闭与空调系统连接的VHP管路上阀门，同时开启空调系统的新风和排风阀，关闭进入房间干燥空气的阀门，将多余的过氧化氢气体通过催化裂解装置分解掉，达到排放标准后通过排风系统除掉。

（1）灭菌过程中湿度的问题
由于移动式VHP发生器一般都自带除湿设备，可以保证灭菌过程中空间内湿度可以控制在40%，此湿度下VHP灭菌效果最佳。但在土耳其V项目中采用的是固定式的VHP灭菌系统，此项目通过采用带转轮除湿的空调机组及单独的干燥空气系统相结合来尽量降低系统湿度。
在此项目中为保证房间的灭菌效果最佳，灭菌前已将灭菌空间达到以下条件：
① 房间的温度≥25℃，湿度≤40%。
② 房间的换气次数≥10次。
③ 冷热水阀通过BMS全自动控制，且送排风机变频控制。
④ 保证灭菌空间所有的门和开口都是关闭状况。
⑤ 通过改变送风风机和排风风机的频率及转轮除湿机达到灭菌前的湿度控制。

（2）灭菌过程中高效过滤器的问题
通常来说，生物医药各洁净室的末端都会有高效过滤器，若VHP需要经过高效过滤器，则会因过滤器介质的吸收作用，使灭杀微生物的速度减慢并因最后阶段的通风时间增加而导致整个灭菌周期延长。该项目系统中的高效过滤器(www.rfilter.com)是设置在空调机组中，故不存在此问题。但若实际应用中，不可避免的要把高效过滤器设置在风管的末端，建议可以通过给高效过滤器设旁路来加快工作区的灭菌速度。当然，VHP对高效过滤器也是可以兼容的，可以选用铝制框架、玻璃纤维介质的高效过滤器，确保密封所用的是硅胶。

（3）空间围护结构密闭性在VHP灭菌系统中的应用
在土耳其V项目中VHP灭菌的洁净室围护结构采用50mm厚夹芯金属隔墙系列彩钢板。VHP灭菌过程中的洁净室密封问题也是施工控制的重点难点之一。此项目围护结构施工顺序按先做顶板再安装墙板顺序执行，这样做更有利于顶板与墙板之间的密封。所有缝隙均用瓷白色中性胶密封，双面打密封胶。不能双面打密封胶的板缝，如靠土建墙板，包柱墙板，夹道墙板等按正压端密封原则进行，安装时应在板缝内预先注入密封胶，采用槽内四点打胶、或对角打胶法将连接配件与板材之间缝隙填密实，确保无泄露。

（4）充气密封门在VHP灭菌系统中的应用
充气式气密门主要应用于使用VHP灭菌空间的进、出口缓冲区。在洁净室内，由彩钢板维护搭建的房间通常视为密闭的，只有在人员及物料进、出品的门需采用密封性可靠的充气密封门做为气闸室的专用门，以保证灭菌过程中，灭菌环境与外部环境完全隔离。

充气密封门主要有三大块功能模块，一是门体充气密封结构，二是互锁控制系统，三是洁净压缩空气充放管路系统。充气式气密门主要由门框、门板、充气密封胶条、充放气控制系统及与相关部件的逻辑控制系统组成，其中充气密封条镶嵌在门板骨架的凹槽内。门框与门板的四角为R＞150mm的圆弧角，门板为三明治结构，中间为保温、隔热材料，两侧面板通过压合制板技术与骨架牢固结合。门框与门板的材质为304不锈钢。如图4所示。

充气式气密门的工作原理为：门开启时，充气膨胀密封条放气收缩在凹槽内；门关闭时，充气密封条充气膨胀，以使门和门框之间形成紧密封闭，同时门被电磁锁锁住。充气密封门的关键验证点为气密的可靠性及控制逻辑的安全性。这一点在土耳其V项目的执行过程中得到充分的验证。出厂的每一扇门在装货前客户都来工厂进行FAT，并确保逐一通过泄露性测试后方可发货。VHP灭菌技术及充气密封门技术在VHP应用领域密不可分。

（5）VHP灭菌整合空调系统的材料应用
① 管路系统
• VHP管道：推荐使用CPVC材质
• 风系统管路：风管采用镀锌钢板制作是可接受的，土耳其V项目的风管用的是镀锌层厚度为180 g的镀锌钢板制作而成，在后期的调试验证使用中未出现问题；管路中的湿度探头不采用铜线圈形式。
② 围护结构
在使用VHP灭菌的房间采用的是氟碳涂层的彩钢板，非VHP灭菌区域使用常规的PE涂层彩钢板。需要使用VHP进行灭菌的洁净室的门推荐采用密胺树脂门，每个独立的灭菌空间与其他系统相连的门均使用气密门。不论使用的是何种建筑材料，在灭菌期间房间必须很好的密封以防止工作暴露于相邻的工作区。

VHP空间灭菌方法研究

1. 目前空间灭菌方法简介

灭菌方法有如下几种：有物理方法、化学方法及生物方法，生物方法利用生物因子去除病原体，作用缓慢，而且灭菌不彻底，一般不采用，故灭菌主要应用物理及化学方法。物理灭菌消毒方法有很多种，用在空间灭菌的方法主要有辐射法。引化学法灭菌能力强，故目前在医疗防疫制药工业中应用最广。以下几种灭菌消毒方法对比表：

2. VHP灭菌消毒方法的研究

2.1概念：

VHP=Vaporized Hydrogen Peroxide--汽化过氧化氢（汽态H2O2）

是一种将过氧化氢液体转化为过氧化氢汽态的方法，因汽态过氧化氢表面积大，能与空间颗粒和悬浮微生物充分接触，达到灭菌消毒的目的。影响VHP灭菌发生效率的因数很多，但主要参数三项：浓重比γ、大颗粒占比β、沉降率α。

2.1.1浓重比γ：

VHP浓度与消耗的过氧化氢液体重量的比值，用γ表示，简称浓重比，是反应过氧化氢转化VHP效率的重要参数，其中环境达到无菌状态的浓重比STγ最为重要。

γ=VHP浓度（PPM）/液态H2O2重量（g）

以灭菌60min的浓重比表示为：γ60

通过浮游菌检测，无菌时浓重比表示为：STγ

2.1.2大颗粒占比 β

大颗粒数与小颗粒数的比值，用β表示，简称大颗粒占比，是综合反应VHP灭菌效率、沉降可能性和VHP残留的重要指标。大颗粒占比越大，表明VHP颗粒沉降就越有可能，灭菌效率就降低，残留也难除去。

β=≥10μm的颗粒数/≥0.5μm的颗粒数

2.1.3沉降率 α

α=沉降水溶液H2O2浓度（mg/L）/消耗H2O2溶液重量（g）

从沉降的H2O2浓度、水溶液的瓶口大小和房间的建筑面积能计算出总沉降的过氧化氢的总量，该沉降的过氧化氢总量与消耗的H2O2溶液的比值能真实反应出沉降部分的占比，也就是反方向间接反应出有效的VHP的比例，该比值越大说明VHP有效部分的越少，反之，该值越小说明VHP有效部分的就越大。为了简化计算，就以达到无菌状态时的沉降水溶液的H2O2浓度与消耗的H2O2溶液重量之比来表示沉降率。

2.2 几种VHP灭菌方法介绍

根据产生过氧化氢汽态的方法分为加热汽化法、常温喷雾法、超声波雾化法等等。几种方法各有各的优点和缺点。

下面根据实验结果，对这几种VHP发生方法做详细阐述。三种灭菌方法对一个可密闭的长4.6m，宽3.9m，高2.5m的房间进行灭菌实验。在房间的墙壁上开一孔，安装灭菌管道。灭菌器的出气管接入至室内。每20min检测一组数据，记录并对数据进行分析。这里几种灭菌方法的检测仪表和检测方法都一样。

2.2.1加热闪蒸法

将过氧化氢液体通过蠕动泵抽取，滴在加热温度长期保持在120~130℃的不锈钢板上，过氧化氢液体瞬间快速蒸发为蒸汽，这些过氧化氢蒸汽被气流送入灭菌环境灭菌。

根据实验数据分析如下：

1）室内温度变化较大，随着VHP蒸汽的注入逐渐升高，最后较开始室温升高了18.8℃。

2）室内湿度随着VHP蒸汽的注入逐渐升高，最后到几乎100%RH。

3）VHP浓度到最高后，随着继续向室内注入VHP蒸汽，其浓度反而下降。

4）悬浮粒子数中的小颗粒数达到最高后，随着继续向室内注入VHP蒸汽，湿度升高，颗粒数反而下降。

5）悬浮粒子数中的大颗粒数，随着向室内注入VHP蒸汽，湿度升高，颗粒数也随之升高。

6）悬浮粒子大颗粒和小颗粒的差值到了最大值之后，随着向室内注入VHP蒸汽，湿度升高到90%RH以上，差值越来越小。

7）沉降的H2O2溶液随着VHP蒸汽的注入其浓度逐渐增加。

得出如下推论：

1）VHP浓度达到最高浓度后，如果继续向室内注入VHP蒸汽，因达到了饱和状态，VHP会有大量沉降，整个灭菌房内处于高湿状态，导致检测VHP汽态的传感器检测到的VHP浓度反而会下降。

2）当向室内注入VHP蒸汽时，湿度会急剧上升，VHP小颗粒会因布朗运动相互碰撞，结合为大颗粒，当颗粒直径达到足够大时会因颗粒重量大于浮力而沉降到地面，所以小颗粒总数会下降。小颗粒数与大颗粒数的差值越来越小，也能解释为小颗粒碰撞结合为大颗粒。

3）随着VHP蒸汽的注入，湿度越来越大，沉降的过氧化氢也越来越多。

2.2.2常温高压喷雾法

运用文丘里原理，压缩空气垂直于毛细管吹动时，在毛细管口形成局部负压，从插在过氧化氢液体瓶里的没毛细管里将过氧化氢吸入至压缩空气管口并粉碎为颗粒，吹入灭菌空间。通过调节压缩空气压力和毛细管的直径可改变形成的颗粒的大小。

高压喷雾实验数据分析如下：

1）室内温度随着VHP雾汽的注入逐渐微跌。

2）室内湿度随着VHP雾汽的注入逐渐升高，最后到几乎100%HR。

3）VHP浓度随着继续向室内注入VHP雾汽而增加。

4）悬浮粒子数中的小颗粒数达到最高后，随着继续向室内注入VHP雾汽，湿度升高，颗粒数反而下降。

5）悬浮粒子数中的大颗粒数，随着向室内注入VHP雾汽，湿度升高，颗粒数也随之升高。

6）悬浮粒子大颗粒和小颗粒的差值到了最大值之后，随着向室内注入VHP雾汽，湿度升高到90%HR以上，差值越来越小。

7）沉降的H2O2溶液随着VHP雾汽的注入其浓度大幅增加。

得出如下推论：

1）VHP浓度在40min后就达到400ppm以上，继续向室内注入VHP雾汽，VHP浓度会继续增加。

2）当向室内注入VHP雾汽时，湿度会急剧上升，VHP小颗粒会因布朗运动相互碰撞，结合为大颗粒，当颗粒直径达到足够大时会因颗粒重量大于浮力而沉降到地面，所以小颗粒总数会下降，大颗粒越来越增加，小颗粒数与大颗粒数的差值越来越小，也能解释为小颗粒碰撞结合为颗粒。

3）随着VHP雾汽的注入，湿度越来越大，沉降的过氧化氢也越来越多。

2.2.3超声波雾化法

运用高频超声波的震动将液体变为颗粒的原理，在过氧化氢管路上安装超声波振动器，能将过氧化氢液体变为VHP颗粒。超声波的振动频率能改变颗粒大小。

根据实验数据分析如下：

1）室内温度随着VHP雾汽的注入逐渐微跌。
2）室内湿度随着VHP雾汽的注入逐渐升高，最后到几乎接近100%RH的饱和状态。

3）VHP浓度随着继续向室内注入VHP雾汽而大幅增加。

4）悬浮粒子数中的小颗粒数随着继续向室内注入VHP雾汽而逐渐增加。

5）悬浮粒子数中的大颗粒数，随着向室内注入VHP雾汽，颗粒数也随之逐渐升高，但大颗粒数增加值不大。

6）悬浮粒子大颗粒和小颗粒的差值随着向室内注入VHP雾汽，差值越来越大。

7）沉降的H2O2溶液随着VHP雾汽的注入其浓度逐渐增加，但增加的幅度不大。

得出如下结论：

1）VHP浓度在40min后就达到400ppm以上，继续向室内注入VHP雾汽，VHP浓度会继续增加，而且增幅较大。

2）当向室内注入VHP雾汽时，湿度会急剧上升，VHP小颗粒会急剧增加，但大颗粒增加很缓慢，小颗粒数与大颗粒数的差值越来越大，可解释为雾化的VHP大部分为小颗粒，大颗粒较少。

3）随着VHP雾汽的注入，湿度越来越大，沉降的过氧化氢也有，但总量和增幅都较小。

3. 结论

根据以上实验数据和推论，汇总做如下比较：

VHP灭菌发生器的超声波雾化法对于雾化的效率最高、灭菌的效率最好、灭菌时间较短、沉降率最低，应作为首选的VHP没灭菌方法。

参考文献：

[1]丁晓明，梁毅。国外汽化过氧化氢（VHP）低温灭菌系统的最新动态观察与探讨[J].机电信息，2010（5）：85.

[2]郁朝阳。汽化过氧化氢灭菌技术及其在动物设施消毒中的应用[J].制药装备应用与研究，2012（2）：89.

[3]王朋。过氧化氢消毒灭菌技术介绍[J].医药工程设计，2012（11）：47.

[4]陈琦。汽化过氧化氢的灭菌技术及其验证分析[J].制药装备，2016（2）：30.

VHP传递窗，3个难以解决的弊端

尽管汽化过氧化氢（VHP）传递窗对于今天的制药企业，已经是一个相当成熟的灭菌传递解决方案，但是汽化过氧化氢（VHP）传递窗仍有几个无法避免的不足之处：

1、VHP传递窗灭菌周期仍然过长，从开始灭菌到排残至1ppm以下，一般小舱体需要1.5小时，大舱体更可能需要3小时左右。时间成本过于昂贵。部分企业为了减少灭菌循环周期，可能在VHP传递窗残留仍有5-10ppm的时候就开舱门取物料。对人员风险加大。

2、VHP传递窗的原理是通过高温闪蒸方式将30%双氧水闪蒸变成过氧化氢气体，在整个灭菌过程中，会导致传递窗温度升高5℃-15℃不等，它不适合生物制品等对温度特别敏感的产品的传递。如果传递窗不升温，高温的过氧化氢气体就极其容易附着在传递窗内部的不锈钢板上产生冷凝的现象。

3、目前国内的VHP传递窗都采用市面上常见的30%~35%食品级（或分析纯级）双氧水溶液，30%双氧水属于危险化学品，易燃易爆，且购买运输储存都需要去当地公安厅备案。而且这种食品级或分析纯级别的双氧水杂质多，对过氧化氢闪蒸盘的寿命损害大。

有没有一种灭菌周期可以更短，温度又不会上升，并且不需要这么高浓度的过氧化氢溶液就能达到6个对数嗜热脂肪芽孢杆菌除菌效果的过氧化氢传递窗，来帮助对时间、对问题有迫切需求的企业。

要想解决上述几个VHP传递窗的弊端，我们先分析存在的技术难点在哪里？

1、VHP传递窗为何灭菌周期过长，我们分析一下它的整个除菌循环的时间分布。VHP传递窗的除菌循环分为除湿、调节、灭菌、通风排残四步。以3m³的VHP传递舱为例，其中除湿：约10分钟；调节：约10分钟；灭菌：约40分钟；通风排残：约1.5~2小时（降到1ppm以下），总计2.5-3小时。

可以看出，通风排残这一阶段占据了整个除菌循环时间的2/3。为什么通风排残时间那么久？？小编认为，主要是由以下四个原因造成的：

1）VHP采用的是30%高浓度的过氧化氢溶液；

2）热蒸发汽化过氧化氢容易产生冷凝（汽相到液相），后期排残过程中慢慢重新释放出来，增加排残难度。

3）高效过滤器等材质容易吸附过氧化氢。

4）过氧化氢蒸汽压比水低。

目前国际上很多企业都在想加快过氧化氢的排残速度，比如Metall-Plastic Germany 改良汽化喷嘴，改良触媒，但是最好的结果也只是：5m³空间1.5小时将H2O2降至0.5PPM。英国的Bioquell想出了通过喷射过氧化氢酶溶液的方法分解过氧化氢，但是因为酶是蛋白质，如果微生物没有除干净，反而变成了微生物的营养物质。所以过氧化氢酶溶液的方法是不行的。

2、关于舱体温度升高的问题，因为VHP的原理就是通过高温闪蒸，所以此技术难点根本无法解决。但是换个思路来考虑，VHP的核心目的是什么？是把过氧化氢溶液从液相变成气相！那么，液相变成气相的方式只有高温一种吗？是否还有别的方法可以做到？

3、关于双氧水的问题，按照国家标准，超过8%过氧化氢溶液就是危险化学品，那么是否可以将过氧化氢溶液浓度降低，降到8%以下，纯度提高，用来解决相应的风险。浓度降低的同时，不也同时解决了排残的技术难题？

随着技术的发展，传统VHP传递窗，难以解决的三个弊端逐渐得到提升和解决。温州维科生物（VHP传递窗行业标准起草单位）最新研究的过氧化氢传递窗，采用了冷蒸发的技术原理，在常温状态下将过氧化氢溶液由液相变成气相，舱体不升温，不凝露，而且整个除菌循环周期小舱体仅需35分钟，大舱体仅需60分钟。大大缩短了传统VHP传递窗漫长的除菌循环周期。并且除菌循环CD更容易开发，更容易验证。

VHP传递窗与新型过氧化氢传递窗的对比：