PCR标准操作流程

试剂

DNA模板

特异性引物

dNTP Mix

PCR buffer

热启动酶

操作步骤

1.配置反应体系

将各成分依次加入到0.5ml的离心管中

扩增使用热启动酶，可在常温下操作，非热启动型的酶要在低温配置反应体系。

2.按照试剂盒说明书设置反应时间和温度，扩增结束后电泳鉴定

3.琼脂糖核酸电泳

  (1)将电泳所用器具蒸馏水洗净，架好梳子

  (2)根据要分离的DNA片段大小制备合适浓度的琼脂糖凝胶，准确称取一定的琼脂糖加入到锥形瓶中，加入30ml左右的电泳缓冲液（TAE或TBE）

  (3)在微波炉中加热融化后冷却至40℃左右，充分混匀后倒入电泳槽中

  (4)室温下凝固40分钟左右，小心拔出梳子，将凝胶放置电泳槽中准备点样

  (5)在电泳槽中加入电泳缓冲液，漫过凝胶表面即可，点样孔内不要有气泡

  (6)样品点样前准备好，（在八连管中）加入5ul样品，1ul的6xLoding buffer和1ul的染料混合，用抢将混合后的样品缓缓注入到点样孔中，注意不要串孔

  (7)按照正负极（红正黑负），接通电源，电压40-60V，时间30-40min，可根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳

  (8)电泳结束，关闭电源，凝胶成像观察，并对比marker确定片段大小

引物

引物是决定PCR反应成败的关键，要保证扩增的准确、高效，引物的设计要遵循如下原则：

  1.引物的设计在cDNA的保守区域，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析的软件，得到不同基因相同的序列就是该基因的保守区

  2.引物的长度：15-28bp，长度大于38bp，会使退火温度升高，不利于普通Taq酶的扩增

  3.引物GC含量在40%-60%，Tm值最好接近72℃

  4.因密码子的简并性，引物的3’端最好避开密码子的第三位（最好为T）

  5.碱基分布错落有致，3’端不超过3个连续G或C

  6.引物自身不要形成发夹结构，引物设计完成，要BLAST验证

模板

PCR扩增对模板的要求不高，单链、双链DNA均可作为扩增片段，虽然PCR能够扩增微量的DNA，为了保证扩增的特异性，对不同来源的模板，起始浓度有一定要求，如下：

模板可以是纯化后的样品也可以是粗制品，不同来源的模板采取不同的处理方法，实验模板的纯化越简单越好，但模板中如果含有任何的Taq酶抑制剂、蛋白酶、核酸酶等，会干扰反应。模板提取注意保存，不能放置太久，避免反复冻融并防止降解。多数人会忽略这一问题，当实验结果没有任何条带时，可优先考虑是否为模板降解的原因。

电泳缓冲液

  1.50xTAE（pH8.5）

准确称取Tris 242g，EDTA（Na）37.2g于1L烧杯中，加入800ml去离子水，搅拌溶解，接入57.1ml乙酸，充分搅拌，调pH值8.5后定容至1L，室温保存。每次使用时稀释即可。

  2.10xTBE（pH8.3）

准确称取Tris 108g，EDTA 7.44g 硼酸55g于1L的烧杯中，加800ml去离子水，充分搅拌溶解，调pH8.3后定容至1L，室温保存。每次使用前稀释即可。

上样缓冲液

6xLoding buffer

0.25%二甲苯青，0.25%溴酚蓝，30%甘油溶于双蒸水中，4℃保存。